激光共聚焦扫描显微镜（LSCM/CLSM）【百测网】-小裤裤笔记漫画

1、仪器简介

    激光扫描共聚焦显微镜 （Laser Scan－ning Confocal Microscopy, LSCM/CLSM）

是 20 世纪80 年代发展起来的、具有较高技术含量的仪器，与传统的光学显微镜相比，

具有高分辨率、高灵敏度等特点。它可以观察标本与组织的深层内部细微结构，

得到清新锐利的显微 CT 图像（光学切片）

还能测量分析细胞形态学参数和荧光强度等

因此在细胞生物学、神经生物学、环境科学、生物化学、食品学和病理学等研究领域中得到了越来越广泛的应用。

2、仪器原理

      CLSM 由光学成像系统、扫描系统、计算机系统三部分组成。

一方面，在传统的光学显微镜的基础上，CLSM 采用激光作为点光源，由于激光具有良好的汇聚性和高能量的特点，大大地缩小了扫描区域，

进而减少了同一视野内相邻样品之间发射信号的干扰。

另一方面，在显微镜的检测器前，在焦平面的共轭位置加装了针孔装置（Pinhole），

从而使得只有来自焦平面的信号能够通过Pinhole，其他非焦平面的信号被 Pinhole 阻挡，

所以检测器只能接收到来自焦平面的发射光信号

实现点对点的成像，即“共轭成像”，从而得到高分辨率的图像。

3、 主要功能

（1）单通道及多通道荧光图像拍摄：这是 LSCM 使用最广泛和最常用的功能之一，

最高成像分辨率可达到 180nm，可以清晰地呈现细胞的微细结构和细胞器，为荧光信号的定位、定性、定量提供直观的图像。此外，还可以获得荧光和明场同时叠加的图片。

（2）多维图像拍摄：

a:Z 轴扫描及三维构建（Z-Stack）：LSCM 通过 Z-stack 可以对样品进行“光学切片”，

用于分析样品的三维立体结构，目标分子的空间分布等。

b：时间序列扫描（Time Series）：时间序列扫描主要用于获取反映样品连续变化的图像信息。时间序列扫描（需配备活细胞工作站）可实现对活细胞的实时动态观测，记录细胞内特定成分的变化并获得动力学曲线。

c：光漂白实验（Bleaching）：光漂白实验主要用于观察靶分子在细胞内或细胞间的运动或定位信息，如荧光漂白后恢复（FRAP），光控蛋白的激活，及荧光共振能量转移等。

d：图像拼接（Tile scan）：图像拼接功能可以将多个视野的图像自动拼接在一起。特别适用于脑或样本较大的组织进行拍摄。

e：多视野扫描（Positions）：多视野扫描可以自动对多个指定视野进行图像拍摄，Position 定位功能主要应用于实现物镜直接切换、实现复位等方面。

4、样品准备

     CLSM 支持观察细胞爬片、共聚焦专用细胞培养皿、组织切片以及临时玻片等制作的样品。CLSM 的高倍镜头通常为油镜，工作 距 离 短 ， 要 求 盖 玻 片 厚 度 不 大 于0.17mm。

a：细胞爬片：载玻片、盖玻片一定要选择质量好、光洁、无杂质的，制备细胞爬片要严格按照相关要求进行。

b：共聚焦专用细胞培养皿：对于悬浮细胞可采用共聚焦专用细胞培养皿进行培养，由于此类培养皿具有特制玻璃底，光透性好，厚度大约只有盖玻片大小。

c：组织切片：组织切片包括冰冻切片、石蜡切片以及

活体切片等，要求切片尽量薄、单层，很好地吸附在载玻片上。

d：临时玻片：观察植物组织的根、茎、叶以及其他组

织时，或是微生物等样品，需要制作临时玻片。有以下两种解决方法：

（1）选择在载玻片上直接制作玻片；

（2）按照一般的方式制作玻片。由于是用水作为封片剂，需要重新加固盖玻片。

     观察细胞爬片、组织切片以及临时玻片均需要封片，不管是永久玻片还是临时玻片，要求样品一定要凝固，不能有液体流动，谨防观察过程液体滴到显微镜上，导致损坏仪器，影响使用。